Биологические основы разработки новых технологий для диагностики и мониторинга дифтерии






НазваниеБиологические основы разработки новых технологий для диагностики и мониторинга дифтерии
страница1/3
Дата публикации19.02.2015
Размер0.49 Mb.
ТипАвтореферат
l.120-bal.ru > Документы > Автореферат
  1   2   3


На правах рукописи
КРАЕВА

Людмила Александровна
БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ РАЗРАБОТКИ НОВЫХ ТЕХНОЛОГИЙ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ И МОНИТОРИНГА ДИФТЕРИИ


03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Санкт-Петербург 2011
Работа выполнена в ФГУН «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера» Роспотребнадзора
Научный консультант:

Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук,

профессор Галина Яковлевна Ценева
Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук профессор Алексей Геннадьевич Бойцов

доктор медицинских наук профессор Алефтина Михайловна Савичева

доктор медицинских наук профессор Евгений Петрович Сиволодский

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная педиатрическая медицинская академия» Федерального агенства по здравоохранению и социальному развитию РФ


Защита диссертации состоится 7 июня 2011 года в _____ часов на заседании диссертационного совета Д 215.002.08 при ФГВОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С.М.Кирова» МО РФ (194044, Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, д. 6).

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ФГВОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С.М.Кирова» МО РФ.

Автореферат разослан ____________ 2011 г.
Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук профессор

Юрий Алексеевич Митин


ОБЩАЯ ХАРАКТРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Эпидемии дифтерии с глубокой древности поражали человечество, перемещаясь по странам и континентам. До получения в 1892 г. Е.Берингом антитоксической сыворотки летальность при дифтерии достигала 50%. Однако защитить от заболевания и стать средством специфической профилактики мог лишь полученный впервые Рамоном анатоксин, нашедший свое применение с 1923 г. Начавшаяся в 40-х годах XX века широкомасштабная иммунизация позволила приостановить развитие эпидемий в странах, вступивших во Вторую мировую войну, и вместе с использованием в лечебных целях антитоксина снизить летальность до 15% (Kwantes W., 1984). Возможность глобальной защиты от дифтерийной инфекции продемонстрирована на примере значительного снижения (почти в 10 раз) заболеваемости после того, как в 1980-х годах дифтерийный анатоксин стал доступен во многих странах. При индексе контагиозности 15-20% самым главным условием предотвращения заболевания становится специфическая профилактика (Galazka AM, 1995; Эмироглу Н., 2001).

Однако, несмотря на проводимую вакцинацию, эпидемии дифтерии периодически повторяются. Масштабная эпидемия дифтерии, поразившая в основном страны СНГ в 1990-х годах, помогла вскрыть недостатки специфической профилактики дифтерии и показала большую роль социальных факторов в создании условий, препятствующих распространению заболеваний среди широких слоев населения (Ценева Г.Я., 1995; Efstratiou A., 1996). Поэтому нельзя ожидать решения проблемы заболеваемости дифтерией лишь принятием мер по возможно полному охвату населения профилактическими прививками.

Без глубокого понимания механизма защиты, создаваемого вакцинными препаратами, трудно понять причину заболеваний среди привитых. Поэтому необходимы более глубокие исследования по характеристике специфических антител, вырабатываемых в ответ на вакцинацию против дифтерии. Разработка ВОЗ и повсеместное внедрение в практику оценочной шкалы защищенности от дифтерии на основании определения количества антитоксических антител позволили контролировать качество вакцинации (Efstratiou A., 1994). Однако информация о количестве вырабатываемых противодифтерийных антител не всегда дает достоверный ответ на вопрос о степени защищенности от дифтерии. Это было продемонстрировано во время последней эпидемии дифтерии в России и после нее, когда у заболевших (до 40% случаев) находили в крови антитоксические антитела защитных уровней (Васильев К.Г., 2002; Матохина А.Г., 2003; Харченко Г.А., 2003).

В современных условиях развитие биотехнологии позволяет разрабатывать эффективные методы диагностики, в том числе при дифтерийной инфекции, с высокой чувствительностью и специфичностью, и следовательно, получать более достоверные данные об иммунном ответе после вакцинации. Так, использование иммуноферментного анализа при оценке защищенности от многих вакциноуправляемых инфекций позволило перейти на новый уровень диагностики с не меньшей достоверностью получаемых результатов, чем при использовании «золотых» стандартов с использованием животных или культур клеток (Camargo et аl, 1987). Поэтому в основе достоверности результата лежит достоверность самого метода диагностики.

Немаловажное значение в защите от дифтерии имеет также социальный фактор. Согласно данным ВОЗ на здоровье человека в 70% случаев влияют прежде всего условия и образ жизни человека, внешняя среда и природные условия (Эмироглу Н., 2001; Харсеева Г.Г., 2009; Volzke H., 2006). Эти факторы лежат в основе формирования и развития неспецифической иммунной защиты. Рядом исследователей установлена тесная связь между регуляторными процессами врожденного и приобретенного иммунитета. Поэтому ответ на введение одних и тех же вакцинных препаратов не может быть одинаковым у всего населения.

Как известно, на ряд показателей здоровья человека влияют стрессы, болезни, вредные привычки и зависимости (Харсеева Г.Г., 2009; WHO/IVB, 2005, 2006; Neal S.E, 2009). В отношении связи специфической иммунной защиты от дифтерии и перечисленных состояний нет информации, хотя во время последней эпидемии дифтерии в России были отмечены высокая заболеваемость и смертность среди лиц, страдающих алкоголизмом.

В развитии любого инфекционного заболевания, в том числе дифтерии, кроме состояния макроорганизма значительную роль играет вирулентность штамма, участвующего в инфекционном процессе. Как известно, главным фактором патогенности C.diphtheriae является его токсигенность. Именно дифтерийный токсин выполняет основную роль в патогенезе заболевания, распространенности инфекционного процесса, развитии осложнений и частоты летальности при дифтерии (Hadfield T.L., 2000; Wellinghausen, N., 2002; Williams H.U., 2008).

В настоящее время в России наиболее распространенным методом выявления токсигенных штаммов является Elek-тест, регламентированный нормативными документами. Однако он не лишен недостатков: длителен в постановке и недостаточно чувствителен. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) обладает более высокой чувствительностью и меньшим временем постановки (Ценева Г.Я., 2000; Pallen M.J., 1994; Aravena-Roman M., 1995; Mikhailovich V.M., 1995). Однако результат ПЦР свидетельствует о наличии у микроорганизма гена токсигенности, который, как известно, может быть репрессированным и не проявлять себя в фенотипических тестах, таких, как Elek-тест. Известно, что при определенных условиях действие гена-супрессора прекращается и штамм возобновляет способность продуцировать токсин (Ценева Г.Я., 1998; Cianciotto N. P., 1997).

В этой связи поиск и разработка эффективных средств индикации и идентификации токсинпродуцирующих штаммов особенно важны, поскольку в постэпидемическом периоде чаще циркулируют штаммы C.diphtheriae, несущие «молчащий» ген токсигенности (Щедеркина Е.Е., 2001).

Исследованиями ряда ученых установлено влияние факторов окружающей среды, в том числе физических, на здоровье населения, неспецифический и специфический иммунитет. Известны данные о влиянии некоторых физических факторов на биологические свойства микроорганизмов, однако эти факты малочисленны, особенно в отношении C.diphtheriae (Грабина В.А., 1976; Гофман Е.Л., 1988; Манина Ж.Н., 1997). Из физических факторов наибольший интерес представляют те, с которыми население контактирует постоянно в течение длительного времени. Развитие средств коммуникации, резкое увеличение количества используемых в быту приборов – приводит к постоянному нахождению людей в электромагнитных полях, хотя и низкой интенсивности. Можно полагать, что в этих условиях микроорганизмы способны менять свои биологические свойства (Рыспаева Д.Э., 1998; Бездольная И.С., 2000, 2001; Думанский Ю.Д., 2001; Боярский М.Р., 2001; Меньшикова Л.Н., 2001; Shckorbatov Y.G., 1998). Однако данные о влиянии электромагнитных полей на те или иные свойства C.diphtheriae до настоящего времени отсутствовали.

Из всех биологических свойств C.diphtheriae наибольший интерес представляют токсинопродукция и адгезия к эпителиальным клеткам слизистых оболочек, являющиеся факторами патогенности штаммов, а также их резистентность к антибиотикам. Особенно важны исследования о возможном влиянии электромагнитных факторов на изменение чувствительности C.diphtheriae к тем антибиотикам, к которым, определялась видовая чувствительность.

Показано, что у больных с острыми заболеваниями верхних дыхательных путей в 10-15% случаев находят недифтерийные коринебактерии (Funke G., 1997; Izurieta H.S., 1997). В настоящее время род коринебактерий включает 67 видов и две таксонные группы, 40 из них представляют клиническое значение. Кроме того, существует ряд коринеформных бактерий, морфологически похожих на коринебактерии, способных вызывать инфекционные заболевания, в том числе верхних дыхательных путей. Расширение спектра новых видов коринебактерий, возможных патогенов, создает значительные трудности в биохимической дифференциации таких культур (Funke G., 1997).

В связи с изложенным представляется актуальным изучение особенностей биологических свойств циркулирующих штаммов C.diphtheriae в постэпидемический период и на этой основе разработка эффективных методов и средств для лабораторного обеспечения надзора за дифтерией.

Цель исследования

Изучить изменчивость биологических свойств C. diphthеriae и динамику показателей гуморального антитоксического иммунитета у привитых для совершенствования лабораторной диагностики и мониторинга дифтерии.

Задачи работы:

  1. Определить роль высокоавидных антитоксических антител в защите от дифтерии. Разработать методику определения индекса авидности антитоксических противодифтерийных антител и критерии невосприимчивости к дифтерии у привитых. Разработать способ дифференциальной диагностики между легкими формами дифтерийной инфекции и бактерионосительством C.diphtheriae.

  2. Разработать методику определения вероятности заболевания дифтерией на основе показателей количественного содержания антитоксических антител и индекса их авидности для оценки индивидуального и коллективного противодифтерийного иммунитета. Определить динамику накопления и регрессии антитоксических, в том числе высокоавидных, противодифтерийных антител у привитых.

  3. Изучить биологические свойства и факторы патогенности C. diphtheriae, выделенных в постэпидемический период (2000-2009 гг.) на территории Санкт-Петербурга, Ленинградской и Вологодской областей.

  4. Изучить влияние электромагнитных полей на вирулентность и чувствительность к антибиотикам штаммов C. diphtheriae.

  5. Разработать экспресс-способ выявления токсигенных C. diphtheriae с использованием высокоавидных антител in vitro.

Научная новизна и теоретическая значимость работы:

Впервые на основе десятилетнего мониторинга индивидуального и коллективного противодифтерийного антитоксического иммунитета в крупных регионах СЗФО РФ научно обоснована определяющая роль высокоавидных антитоксических антител в защите от дифтерии у привитых.

Разработаны новые методические подходы, критерии и способы оценки защищенности от дифтерии. Впервые на основе комплекса данных об уровнях антитоксических, в т.ч., высокоавидных, антител и прививочного статуса разработан способ прогнозирования заболеваемости контактных в очагах инфекции.

Разработан алгоритм контроля индивидульного и коллективного иммунитета для определения сроков ревакцинации с учетом динамики антитоксических, в т.ч., высокоавидных, антител.

Показано влияние некоторых факторов электромагнитного излучения на биологические свойства возбудителя дифтерии. Установлено стимулирующее влияние НИЛИ на продукцию дифтерийного токсина in vitro штаммами C. diphtheriae, в т.ч., несущими «молчащий» tox-ген.

Доказана эффективность использования высокоавидных антител для выявления продукции дифтерийного токсина у штаммов C. diphtheriae с низким уровнем токсинообразования in vitro. Предложен новый алгоритм определения токсигенности C. diphtheriae, в т.ч., несущих «молчащий» tox-ген.

Практическая значимость исследования:

Предложен комплекс современных методов и приемов для обеспечения микробиологического мониторинга возбудителя дифтерии и оценки поствакцинального иммунитета.

Обоснована целесообразность обследования с профилактической целью контингентов, особенно лиц из закрытых учреждений, на носительство C. diphtheriae в постэпидемический период.

Разработан экспресс-способ выявления токсигенных штаммов C.diphtheriae, отличающийся высокой чувствительностью, быстротой учета реакции, объективностью считывания информации, портативностью и экономичностью.

Разработан высокочувствительный экспресс-способ обнаружения потенциальной токсинопродукции у штаммов C.diphtheriae, несущих «молчащий» ген токсигенности и слабо продуцирующих токсин, позволяющий повысить эффективность лабораторной диагностики дифтерии.

Предложены методические материалы (схемы, прописи сред, таблицы биохимического типирования, текстовый материал) для дифференцирования C. diphtheriae и недифтерийных коринебактерий.

Полученные данные изложены:

а) в методических рекомендациях для врачей «Фенотипическая идентификация бактерий рода Corynebacterium», утв. МЗ РФ 2010 г.;

б) в Руководстве по клинической лабораторной диагностике, раздел «Коринебактерии», Из-во Москва, 2011 г.

Изученные штаммы C.diphtheriae и их характеристики представлены в коллекции лаборатории бактериальных капельных инфекций НИИЭМ имени Пастера, Санкт-Петербург (2003-2010 гг.).

Разработан простой и экономичный тест для измерения авидности противодифтерийных антитоксических антител на основе ИФА, позволяющий определять истинные протективные антитела. Данные по проведению и использованию ИФА в практических лабораториях изложены в Учебном пособии «Дифтерия (современные методы лабораторной диагностики), Санкт-Петербург, 2009 г.

Предложен алгоритм лабораторного контроля иммунитета, включающий определение количественного показателя степени невостприимчивости обследуемых к дифтерии, сроков сохранения высокоавидных антител, серологического мониторинга и проведения очередных ревакцинирующих прививок.

Предложены новые критерии защищенности населения от дифтерии, позволяющие оперативно проводить коррекцию ревакцинации в слабо защищенных группах населения.

На основании данных индекса авидности предложена схема проведения дифференциальной диагностики заболеваний дифтерией и бактерионосительства C.diphtheriae.

Для оперативного микробиологического и серологического мониторинга дифтерии созданы базы данных, включающие данные по заболеваемости дифтерией, показатели иммунитета, сведения о выделенных штаммах C. diphtheriae, предложена методология создания геоинформационной системы по слежению за дифтерийной инфекцией. Компьютерное картирование эпидемиологических и микробиологических данных на территории наблюдения и банк специфических данных делают получение информации экстренной.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

  1. Невосприимчивость привитых к дифтерии связана с формированием высокоавидных антитоксических антител.

  2. Комплексная оценка противодифтерийного поствакцинального иммунитета основана на определении количественного содержания и индекса авидности антитоксических антител.

  3. Штаммы C.diphtheriae, выделенные в постэпидемический период, характеризует изменчивость основных биологических свойств (патогенности, чувствительности к антибиотикам).

  4. Низкоинтенсивное лазерное излучение и вращающиеся магнитные поля влияют на адгезивность, токсигенность и чувствительность к антибиотикам штаммов C. diphtheriae in vitro.

  5. Новые биомикротехнологии повышают эффективность выявления токсинообразования штаммами C. diphtheriae in vitro .

Внедрение результатов работы:

На основе результатов работы подготовлены следующие документы:

Учебные пособия для врачей «Дифтерия» (современные методы лабораторной диагностики) Г.Н. Беспалова, Л.А. Краева, Г.Я. Ценева, О.Е. Пученко. СПб, 2009.-42 с. (используется в учебном процессе на кафедре микробиологии и микологии ГОУ ДПО СПб МАПО Росздрава и на кафедре микробиологии Военно-медицинской академии имени С.М. Кирова).

Методические рекомендации для врачей-бактериологов «Фенотипическая идентификация бактерий рода Corynebacterium» Г.Я. Ценева, Л.А. Краева, Ж.Н. Манина и др. СПб-Харьков, 2010. - 76 с.

Патент на изобретение «Способ контроля биологической пробы в реакции латекс-агглютинации и аналитическая система для его осуществления».- № 2298798 от 10.05.2007.- Авторы: Зимина Т.М., Лучинин В.В., Мигунова В.Е., Краева Л.А., Ценева Г.Я., Меньшикова А.Ю., Шабсельс Б.М., Дулатова М.В., Шпилюк Г.Ф.

Патент на изобретение «Способ определения токсигенности бактерий Corynebacterium diphtheriae» № 2370539 от 20.10.2009.- Авторы: Краева Л.А., Ценева Г.Я., Коробов А.М., Грабина В.А.

Материалы диссертации представлены в «Руководстве по клинической лабораторной диагностике» (Раздел: Коринебактерии) М. 2011.

Апробация работы:

По теме диссертации опубликованы: 40 научных работ, в том числе 12 – в изданиях, рецензируемых ВАК, а также в материалах симпозиумов, научно - практических конференций всероссийского и международного уровней.

Основные результаты исследований доложены и обсуждены на российских и международных семинарах, конгрессах и конференциях в 2003-2010 гг.: 17-19 ноября 2003 г. Семинар ВОЗ «Лабораторная диагностика дифтерии», СПб, НИИЭМ им. Пастера; 8-9 октября 2004 г. Гомель, Беларусь, ОЦГСЭН. Международная конференция «Применение антибактериальных препаратов при лечении инфекционных заболеваний»; 23-26 мая 2005 г. IX Всероссийский научный форум «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге»; 5-8 октября 2005 г. Ялта, Украина. XXIV Международная научно-практическая конференция «Применение лазеров в медицине и биологии»; 7 февраля 2006 г. НИИЭМ им. Пастера, СПб, заседание общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов в Санкт-Петербурге и Ленинградской области; 5-8 октября 2006 г. Луцк. Украина. XXV Международная научно-практическая конференция «Применение лазеров в медицине и биологии»; 15-17 November 2006. Vouliagmeni, Greece. Ninth International Meeting of the European Laboratory Working Group on Diphtheria, ELGWD; 26 мая 2007 г. ГОУ ДПО СПб МАПО Росздрава. Всероссийская научная конференция «Современные проблемы медицинской микробиологии» (Хлопинские чтения); 5-7 декабря 2007 г. Алматы (Казахстан). Республиканский семинар «Диагностика воздушно-капельной группы инфекций»; 26 февраля 2008 г. НИИЭМ им. Пастера, СПб, заседание общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов в Санкт-Петербурге и Ленинградской области; 24 апреля 2008 г. НИИЭМ им. Пастера, СПб, семинар для врачей-бактериологов СПб и Лен. Области; 2-4 июня 2008 г. Четвертая международная конференция, посвященная 85-летию Санкт-Петербургского НИИЭМ имени Пастера и 120-летию Парижского института Пастера; 1-4 июля 2008 г. Второй Санкт-Петербургский международный экологический форум «Окружающая среда и здоровье человека»; 03-07 November 2008. Larnaca.Cyprus. Tenth International Meeting of the European Laboratory Working Group on Diphtheria, ELGWD; 7-9 October 2009. Ryga. Eleventh International Meeting of the European Laboratory Working Group on Diphtheria, ELWGD; 16-17 декабря 2009 г. Вологда. Пленум, посвященный 65-летию Российской академии медицинских наук и 130-летию со дня рождения академика АМН СССР А.Н. Сысина; 18-20 mai 2010 г. Saint-Petersburg. Recherches scietifiques et surveillance epidemiologique des maladies infectieuses. Conference internationale Saint-Petersburg; 08 июня 2010 г. НИИЭМ им. Пастера, СПб, заседание общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов в Санкт-Петербурге и Ленинградской области; 15 сентября 2010 г. Вологда. Научно-практическая конференции ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Вологодской области»; 6-8 октября 2010 г. Судак. Украина. XXXIV Международная научно-практическая конференция «Применение лазеров в медицине и биологии».

Личный вклад автора

Основные результаты получены лично автором. Выделение штаммов C. diphtheriae, сбор сывороток от больных и здоровых лиц проведен в Центрах эпидемиологии и гигиены в Вологодской, Ленинградской областях, г. Санкт- Петербурге, а также лично автором.

Приборы лазерного излучения были предоставлены НИИ Лазерной биологии и лазерной медицины, Харьков, Украина.

Микробиологические, серологические, иммунохимические, экспериментальные исследования, компьютерный и статистический анализ данных были проведены автором в лаборатории бактериальных капельных инфекций ФГУН «Санкт – Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

Структура и объем диссертации:

Основной текст диссертации изложен на 235 страницах машинописного текста и состоящий из введения, аналитического обзора литературы, характеристически материалов и методов исследования, 6 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, приложений.

Диссертация иллюстрирована 16 таблицами и 43 рисунками. Список литературы содержит 114 источников отечественных авторов и 269 источников зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследований

В соответствии с целью и задачами исследования был использован следующий материал и применены методы, представленные в таблице 1.

Таблица 1.

Объем проведенных исследований различными методами

Методы

Объем

  1. Бактериологический:

    1. Изучение характеристик циркулирующих штаммов C.diphtheriae.

    2. Изучение влияния факторов электромагнитной природы на основные биологические свойства C.diphtheriae.

    3. Сравнение методов определения токсигенности у штаммов C.diphtheriae.

    4. Изучение клинической значимости Corynebacterium non diphtheriae, их дифференциация с C.diphtheriae.

    5. Изучение чувствительности к антибиотикам штаммов Corynebacterium non diphtheriae.

    6. Оценка экспресс-способа выявления потенциальной токсигенности у штаммов C.diphtheriae с помощью низкоинтенсивного лазерного излучения


650 штаммов
132 шт.
304 шт.
116 шт.
60 шт.
80 шт.

Всего 1342 штамма

  1. Иммунологический:

    1. Выбор достоверного метода определения защищенности от дифтерии.

    2. Оценка уровней АТ-АТ по международным стандартам.

    3. Выделение групп «риска» по возрасту.

    4. Выделение групп «риска» по основной хронической патологии.

    5. Выделение групп «риска» по профессиональной принадлежности.

    6. Разработка теста для определения авидности антитоксических антител.

    7. Изучение динамики показателей защищенности от дифтерии

    8. Лабораторные приемы для дифференциальной диагностики малосимптомных форм инфекции и бактерионосительства.

350 образцов сыворотки крови (ОСК)
3 012 ОСК

216 ОСК

189 ОСК.
130 ОСК
185 ОСК

450 ОСК
50 ОСК

Всего

4 582 ОСК

  1. Иммунохимический:

    1. Апробация экспресс-способа выявления дифтерийного токсина на основе микротехнологий.

30 штаммов

( в 3-х повторностях)

  1. Молекулярно-генетический: ПЦР

304 штамма

  1. Экспериментальные модели:

5.1. РН в культуре клеток Vero,

5.2. Изучение адгезивности на эритроцитах человека

0 () группы Rh (+).


350 ОСК
9 ОСК

  1. Анализ историй болезни

185 историй болезни


Методы культивирования штаммов.

Для выполнения исследований использованы штаммы C.diphtheriae, выделенные автором и полученные из Санкт-Петербурга, Ленинградской и Вологодской областей за период 1995-2009 гг.

Выделение и идентификацию микроорганизмов проводили в соответствии с Методическими указаниями «Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции» (МУ 4.2.698-98), «Определителем бактерий Берджи» (1997), учебным пособием «Микробиология» под редакцией В.И.Покровского (1999), руководством по лабораторной диагностике ВОЗ «Дифтерия» (1994 г., 2009 г.), учебным пособием для врачей «Дифтерия. Лабораторная диагностика» (2009 г.), схемами идентификации коринебактерий, предложенные Guido Funke et al. (1997) и Manual of Clinical Microbiology (2 Volume Set), Patrick R. Murray (2007).

В работе использованы референс-штаммы C.diphtheriae № 10356 (tox-), № 10648 (tox+) и № 3984 (tox+/-) из NCTC (National Collection of Type Cultures Diphtheriae Reference Laboratory, Central Health Laboratory (CPHL), London, UK).

Изучение основных патогенных свойств и антибиотикорезистентности коринебактерий.

Степень адгезии микроорганизмов определяли пользуясь средним показателем адгезии (СПА) по методу В.И. Брилис (1986) на эритроцитах человека О (I) группы Rh+.

Для определения токсигенности C.diphtheriae использованы 5 тестов: полимеразная цепня реакция (ПЦР), иммунохроматографический тест (ICS), иммунопреципитация в агаре (Elek-тест), реакция непрямой гемагглютинации (РНГА), реакция агглютинации латекса (РАЛ).

Постановку ПЦР со специфическими праймерами проводили в режиме амплификации, описанном в инструкции по применению тест – системы для выявления участка ДНК 360 пар нуклеотидов гена токсина коринебактерии дифтерии производства «АмплиСенс», г. Москва.

Для постановки ICS-теста использовали диагностический набор, полученный из Diphtheriae Reference Laboratory (CPHL), London, UK.

Elek-тест проводили по общепринятой методике, согласно МУ 4.2.698-98 с использованием среды ОТДМ для определения токсигенности дифтерийных микробов производства НПО «Питательные среды» г. Махачкала, Россия. Для приготовления бумажных дисков применяли «Антитоксин диагностический дифтерийный очищенный ферментолизом и специфической сорбцией, сухой» производства НПО «Биомед», г. Пермь.

Для постановки РНГА использовали диагностический набор с эритроцитарным диагностикумом (производства НИИЭМ им. Пастера, С-Петербург).

Для проведения РАЛ использовали диагностический набор «ID-PaGIA Diphtheria Toxin Test» и оборудование (центрифуга, пластиковые карты, включающие 6 микропробирок с гелем Sephadex) СП Германия – Россия, ГРМИ № 94/256.

Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам проводили методом серийных разведений и диско-диффузионным методом согласно МУК 4.12.1890-04 (Москва, 2004), “Basic laboratory procedures in clinical bacteriology” (WHO, Geneva, 1991, раздел “Определение чувствительности к антимикробным препаратам”) и руководства ВОЗ "Основные методы лабораторных исследований в клинической бактериологии" (1994). В качестве среды для постановки теста использовали бульон и агар Мюллера-Хинтона с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота. Для контроля качества сред использовали стандартные штаммы: Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 25922), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853). В качестве контрольных штаммов для оценки чувствительности использовали Corynebacterium diphtheriae var. gravis (tox+) (NCTC 10648) и Staphylococcus aureus (ATCC 25923).

Иммунологические методы

РН (реакция нейтрализации) в культуре клеток Vero

В реакции использовали токсин 0,0002 Lf/мл и антитоксин 0,032 МЕ/мл, полученные из NCTC (National Collection of Type Cultures Diphtheriae Reference Laboratory, Central Health Laboratory (CPHL), London, UK). При постановке реакций применяли культуру клеток Vero, полученную из лаборатории детских вирусных инфекций НИИЭМ им. Пастера, в концентрации 2,5·105 клеток/мл. Содержание антитоксических антител определяли от 0,000125 МЕ/мл и выше.

Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА)

В работе использовали эритроцитарный дифтерийный антигенный жидкий диагностикум производства «Биомед» им. И.И.Мечникова (Московская обл., Красногорский район, с. Петрово-Дальнее) активностью 1:6 400.

Иммуноферментный анализ (ИФА)

Тест-система для ИФА представляет собой набор, предназначенный для определения суммарных антитоксических антител на основе конъюгата - иммуноглобулинов (F(ab')2-фрагментов) диагностических против IgG человека, аффинноочищенных, меченных пероксидазой (производства НПО «Биомед, г. Пермь). Специальная компьютерная программа, прилагаемая к набору, дает возможность производить перерасчет показателей оптической плотности в показатели антитоксических международных единиц.

Для определения авидности антител использовали эту же тест-систему, которую модифицировали путем введения дополнительных 2-х контролей: контрольный положительный образец (К+) – сыворотка крови человека с индексом авидности 95% и контрольный отрицательный образец (К-) - сыворотка крови человека с индексом авидности 5%, а также других ингредиентов и разработанных условий проведения реакции.

Экспресс-способ выявления дифтерийного токсина на основе микротехнологий

Способ разрабатывался с использованием 7 контрольных (положительных и отрицательных) референс-штаммов и токсинов, полученных из NCTC (National Collection of Type Cultures Diphtheriae Reference Laboratory, Central Health Laboratory (CPHL), London, UK), ГИСК им. Л.А.Тарасевича и НИИЭМ имени Пастера (Россия). Апробацию способа осуществляли на 30 известных музейных штаммах C.diphtheriae в трех повторностях.

Экспресс-способ выявления потенциальной токсигенности у штаммов C.diphtheriae

При разработке способа применяли лазерный прибор для микробиологических исследований «Барва ЛПМИ – 01» производства Харьковского НИИ лазерной биологии и лазерной медицины.

В экспериментальной части использованы референс-штаммы C.diphtheriae № 10356 (tox-), № 10648 (tox+) и № 3984 (tox+/-) из NCTC (National Collection of Type Cultures Diphtheriae Reference Laboratory, Central Health Laboratory (CPHL), London, UK). Апробация способа осуществлялась на 80 штаммах музейных культур C.diphtheriae.

Эпидемиологические методы

Эпидемиологические методы использовали при изучении заболеваемости населения Санкт-Петербурга, Ленинградской и Вологодской областей за период с 2000 по 2009 гг. Данные о заболеваемости были предоставлены центрами Государственного санитарно-эпидемиологического надзора на изучаемых территориях. Показатели привитости населения от дифтерии, данные о циркуляции выделенных штаммов C.diphtheriae были получены из бактериологических лабораторий вышеуказанных территорий.

При определении групп «риска» среди населения по восприимчивости к дифтерийной инфекции также были использованы эпидемиологические методы. Учитывали группы населения по возрасту, профессии, наличию или отсутствию хронического заболевания.

Методы математической обработки данных

В работе использованы интенсивные, экстенсивные показатели и показатели наглядности. Математическая обработка включала следующие методы: расчет первичных статистических показателей; выявление отличий между группами по статистическим признакам; установление взаимосвязи между переменными с помощью параметрического и непараметрического корреляционного анализа; установление вида зависимостей (показателей от изучаемых факторов) с помощью регрессионного анализа.

  1   2   3

Добавить документ в свой блог или на сайт

Похожие:

Биологические основы разработки новых технологий для диагностики и мониторинга дифтерии iconСапожников В. В. Основы технической диагностики: Учеб пособие для...
Основы технической диагностики: Оптимизация алгоритмов диагностирования, аппаратурные средства/ П. П. Пархоменко, Е. С. Согомонян....

Биологические основы разработки новых технологий для диагностики и мониторинга дифтерии iconГарбук С. В., Гершензон В. Е. Космические системы дистанционного зондирования Земли
Исследование прикладных задач космического мониторинга и разработка новых технологий. Системы космических средств связи, спутниковая...

Биологические основы разработки новых технологий для диагностики и мониторинга дифтерии iconУчебно-методический комплекс Дисциплины «Агроэкология»
В четвертом разделе анализируются популяционно-биологические и фитоценологические методы, используемые для характеристики редких...

Биологические основы разработки новых технологий для диагностики и мониторинга дифтерии iconОбеспечение эпидемиологической безопасности эндоскопических вмешательств...
В последние годы применение современных высокотехнологичных методов диагностики и лечения, в т ч эндоскопических, значительно расширено....

Биологические основы разработки новых технологий для диагностики и мониторинга дифтерии iconКонспект лекций москва 2014 V 3 Оглавление Введение 3 Среда разработки...
Появилась также тенденция к разделению процесса создания приложения на две составляющие

Биологические основы разработки новых технологий для диагностики и мониторинга дифтерии iconПрограмма дисциплины «Основы проектирования и разработки баз данных в среде ms access»
Программа предназначена для преподавателей, ведущих данную дисциплину, учебных ассистентов и студентов экономических специальностей,...

Биологические основы разработки новых технологий для диагностики и мониторинга дифтерии iconДемчишин Юрий Владимирович
В настоящее время существует большое количество технологий разработки веб-сайтов. Можно для разработки веб-сайта использовать готовую...

Биологические основы разработки новых технологий для диагностики и мониторинга дифтерии iconВ первой главе проведен анализ предметной области, рассмотрены аналоги...
В данной работе представлена разработка программных средств системы мониторинга автоматов продажи проездных билетов, а точнее приложение...

Биологические основы разработки новых технологий для диагностики и мониторинга дифтерии iconАвтоматизированные системы мониторинга электропотребления и расчеты...
Представлен анализ современных автоматизированных систем мониторинга и учета электропотребления с точки зрения получения информации...

Биологические основы разработки новых технологий для диагностики и мониторинга дифтерии iconРабочая программа дисциплины
Пререквизиты: минералогия, петрография, литология, основы учения о полезных ископаемых (основы теории рудообразующих процессов),...

Вы можете разместить ссылку на наш сайт:


Литература


При копировании материала укажите ссылку ©ucheba 2000-2015
контакты
l.120-bal.ru
..На главную