Строение и состав продуктов экстракции и модификации биологически активных соединений в среде субкритической воды
Скачать 290.33 Kb.
|
На правах рукописи Борисенко Сергей Николаевич СТРОЕНИЕ И СОСТАВ ПРОДУКТОВ ЭКСТРАКЦИИ И МОДИФИКАЦИИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ В СРЕДЕ СУБКРИТИЧЕСКОЙ ВОДЫ 02.00.04 – физическая химия автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Ростов-на-Дону 2009 Работа выполнена в Научно-исследовательском институте физической и органической химии Южного федерального университета
Ведущая организация: Международный Томографический Центр СО РАН Защита диссертации состоится 13 ноября 2009 года в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 212.208.14 при Южном федеральном университете по адресу: 344090, г. Ростов-на-Дону, пр. Стачки 194/2, НИИ ФОХ ЮФУ конференц-зал. С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Южного федерального университета по адресу: 344006, г. Ростов-на-Дону, ул. Пушкинская 148). Автореферат разослан 12 октября 2009 года
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Поиск экологически безопасных методов экстракции и химической модификации фармацевтически значимых соединений растительного происхождения является одним из приоритетных направлений современной химии. Замена токсичных органических растворителей экологически чистыми суб- и суперкритическими флюидами, такими как СО2 и вода, является наиболее перспективным подходом к решению поставленных задач. В последнее десятилетие, для экстракции и химической модификации биологически активных соединений предложено использовать субкритическую воду (перегретая вода под давлением при температурах от 100оС до 374оС). Для России, с ее богатейшими растительными ресурсами, возможность использования субкритической воды в технологических процессах является чрезвычайно актуальной и имеет огромное практическое значение, особенно с учетом экологической чистоты, доступности и дешевизны воды (по сравнению с традиционными токсичными и дорогостоящими органическими растворителями). Поэтому, исследования, нацеленные на разработку экологически чистых методик экстракции и химической модификации биологически активных соединений в среде субкритической воды, являются актуальными и имеют значительный инновационный потенциал. Цель работы: разработка экологически чистых методик экстракции и химической модификации биологически активных соединений в среде субкритической воды и установление состава полученных продуктов с использованием масс-спектрометрии с ионизацией электроспреем и спектроскопии ЯМР. В задачи исследований входило: 1) Разработка экологически чистых методик (без использования органических растворителей) экстракции и химической модификации в среде субкритической воды биологически активных соединений растительного происхождения, имеющих значительный фармацевтический потенциал. 2) Установление строения и состава полученных продуктов с использованием физико-химических методов: спектроскопии ЯМР и масс-спектрометрии с ионизацией электроспреем. 3) Сравнение эффективности методик с использованием субкритической воды для получения биологически активных биофлавоноидов и тритерпеновых гликозидов с результатами традиционных методов экстракции, основанных на применении органических растворителей в качестве экстрагента. 4) Изучение изомеризации изохинолинового алкалоида глауцина в фенантреновый природный алкалоид дес-глауцин. 5) Синтез в среде субкритической воды одного из интенсивно изучаемых макроциклов - циклотривератрилена. Научная новизна. Впервые среда субкритической воды использована для экстракции биофлавоноидов кверцетина и дигидрокверцетина, а также для извлечения смеси аралозидов из аралии манчжурской – биологически активных соединений растительного происхождения, имеющих значительный фармацевтический потенциал, как в РФ, так и за рубежом. Осуществлена изомеризация природного алкалоида апорфинового ряда глауцина в фенантреновый алкалоид дес-глауцин в среде субкритической воды с выходом, в три раза превышающим лучший из описанных ранее в литературе результатов. Впервые в среде субкритической воды осуществлён синтез макроциклических соединений циклотривератрилена и циклотетравератрилена. Практическая ценность работы. Продемонстрированы принципиальные преимущества использования субкритической воды (горячей воды под давлением) для извлечения биологически активных соединений класса биофлавоноидов и тритерпеновых гликозидов по сравнению с традиционными методами. Разработаны методы изучения строения продуктов и анализа состава смесей, полученных как в результате экстракции из природных объектов, так и в ходе химических реакций в среде субкритической воды, с использованием жидкостной хроматомасс-спектрометрии с ионизацией электроспреем. Предложены экологически безопасные методики получения биологически активных биофлавоноидов в среде субкритической воды, обладающих широким спектром терапевтического действия (антиоксидантное, капилляроукрепляющее действие и др.), присущего как индивидуальным веществам из группы флавоноидов, так и их смесям, что позволяет создавать на их основе большое число лекарственных форм. Предлагаемые методики экстракции и синтеза в среде субкритической воды, как правило, более эффективны и экологически безопасны по сравнению с традиционными подходами, основанными на использовании дорогостоящих и токсичных органических растворителей. Предлагаемые подходы открывают возможности получения перспективных с фармакологической точки зрения соединений в экологически чистых реакционных средах. По материалам работы подано 4 заявки на изобретения. Апробация работы. Основные результаты работы представлены на III Международной научно-практической конференции “Сверхкритические флюидные технологии: инновационный потенциал России”, (Ростов-на-Дону; 11-12 октября 2006); IX Международном Семинаре по магнитному резонансу (спектроскопия, томография, экология) 15 – 20 сентября 2008 год; V Международной научно-технической конференции “Актуальные вопросы теоретической и прикладной биофизики, физики и химии. БФФХ-2009”, (Севастополь, 21–25 апреля 2009); IV, V Международной конференции по новым технологиям и приложениям современных физико-химических методов (Ростов-на-Дону, 18-22 сентября 2007, 1 - 5 июня 2009), V Международной научно-практической конференции «Сверхкритические флюиды: фундаментальные основы, технологии, инновации» (Суздаль, 15–18 сентября 2009); V Ежегодной научной конференции студентов и аспирантов базовых кафедр Южного научного центра РАН, (г. Ростов-на-Дону, 2009), III Всероссийской конференции «Аналитика России» (г. Краснодар, 27 сентября – 2 октября 2009 г.) Работа выполнена при поддержке грантов Министерства образования и науки РФ (РНП 2.2.2.23915 и 2.1.1.4939), президента РФ по поддержке ведущих научных школ (НШ-363.2008.03) и Американского фонда гражданских исследований и развития (США) по Российско-американской программе “Фундаментальные исследования и высшее образование” (гранты CRDF BP3C04, BP4M04). Частично полученные в работе результаты использовались для реализации проекта по программе Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере СТАРТ-06 (г/к 4366р/6813). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 16 работ, включая 5 статей в журналах, рекомендуемых ВАК, и 11 работ в материалах и тезисах докладов Международных и Всероссийских конференций и семинаров. Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, 3 глав, выводов, списка цитируемой литературы (209 наименований) Работа изложена на 108 страницах, содержит 44 рисунков и 9 таблиц. Во введении обосновывается актуальность диссертационной работы, сформулированы цели и задачи исследования. Глава 1 диссертации содержит обзор литературы, где рассмотрены основные теоретические и экспериментальные данные по применению суб- и суперкритических флюидных сред для экстракции и модификации различных соединений. Отмечено, что вода, находящаяся в жидком субкритическом состоянии (при температурах выше 100 °С и ниже 374 °C и давлении, обеспечивающим нахождение воды в жидкой фазе), является весьма эффективным и экологически чистым инструментом экстракции и химической модификации биологически активных соединений, за счет возможности изменения ее физико-химических свойств (диэлектрической проницаемости, ионного произведения, диффузионных свойств и плотности) при увеличении давления и температуры. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Экстракцию субкритической водой в проточном режиме проводили с помощью специально разработанной и изготовленной оригинальной установки (рис. 1).
С использованием разработанной установки изучена возможность экологически чистого способа выделения флавоноидов из растительного сырья на примере естественного антиоксиданта – кверцетина.  
В качестве сырья использовали горец перечный (Polygonum hydropiper L., спорыш). Экстракцию проводили перегретой водой (субкритической водой) при температуре до 250ºС и давлении 120 атм в течение 30 минут. Соответствующая хроматограмма смеси представлена на рис 2.  Рис. 2 Хроматограмма экстракта, полученного в среде субкритической воды из травы горца перечного(Polygonum hydropiper L.) Для оценки эффективности предложенной экстракции в среде субкритической воды проведено сравнение с результатами экстракции, полученных традиционным метанольным методом извлечения флавоноидов. Результаты представлены в таблице № 1. Таблица №1 Содержание флавоноидов и кверцетина в экстрактах горца перечного, полученных различными способами.
Установлено, что экстракция субкритической водой позволяет извлечь кверцетина в 7,6 раз больше по сравнению с традиционным способом. В то же время, общая сумма флавоноидов, регистрируемая в экстракте, полученном в субкритической воде, меньше, чем при традиционной метанольной экстракции. Для изучения причин такого поведения, экстракция в среде субкритической воды была осуществлена в нескольких температурных интервалах. Результаты исследований показали, что при температурах ниже 100 °С кверцетина извлекается столько же, сколько извлекается традиционной метанольной экстракцией (44,0 мкг/г),. При нагревании воды от 100ºС – до 150ºС извлекается 61,3 мкг/г , а в интервале от 150ºС до 250ºС извлекается дополнительно еще 222,7 мкг/г (рис. 3).  Рис. 3 Зависимость содержания кверцетина в смесях экстрактов горца перечного (Polygonum hydropiper L.), полученных различными способами Следует предположить, что повышение температуры воды способствует высвобождению кверцетина, связанного в растительной матрице. В частности, это может быть результат реакции гидролиза присутствующих в растительной матрице гликозидов биофлаваноидов, таких, например, как рутин или его (кверцетина) другие гликозиды. Это косвенно подтверждается наблюдаемым в эксперименте уменьшением площадей хроматографических пиков флавоноидов при сравнении с результатами традиционной экстракции (Табл.1). Разработанная установка была использована для изучения процесса гидролиза рутина III (дигликозида образованного кверцетином и восстанавливающими сахарами глюкозой VI и рамнозой V) до кверцетина I в среде субкритической воды. Cхема реакции представлена на рисунке 4. 
Рис. 4 Схема получения кверцетина I из рутина Ш в субкритической воде Результаты хроматографии стандартного раствора рутина и экстракта, полученного на установке через 30 мин. приведены на рис. 5а и 5б соответственно.
Рис. 5 а) Хроматограмма рутина; б) хроматограмма смеси, полученной из рутина в среде субкритической воды В отличие от хроматограммы стандартного раствора рутина, которая содержала один пик с временем выхода 7.7 мин. (Рис. 5), в смеси, полученной из рутина в среде субкритической воды, наблюдаются хроматографические пики с временами выхода от 6.18 до 7.75 и 9.32 мин, что может соответствовать смеси из двух и более соединений (пик 6.18 – 7.75 мин уширен). Для определения качественного состава смеси, с использованием масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением были исследованы компонентные составы соответствующих хроматографических пиков. Для пика (6.18 - 7.75 мин) при регистрации положительных ионов обнаружены ионы с m/z 303.2 (протонированный молекулярный ион кверцетина); 465.3 (протонированный молекулярный ион фрагментации рутина); 611.4 (протонированный молекулярный ион рутина) (рис.6). Аналогично, в масс-спектре отрицательно заряженных ионов наблюдается пик с m/z 609,3 (депротонированный молекулярный ион рутина), соответствующий рутину.  Рис. 6 Масс-спектры положительных (а) и отрицательных ионов (б), полученные для пика с временем выхода 7,22 мин Для хроматографического пика 9,32 мин, при регистрации отрицательных ионов в масс-спектре наблюдаются только ионы с m/z 301.2 (депротонированный молекулярный ион кверцетина), соответствующие кверцетину. Что доказывает эффективность процессов гидролиза рутина в условия субкритической воды с образованием кверцетина, без применения кислотного катализатора, обычно используемого в этих случаях. Данный механизм может осуществляться и при экстракции кверцетина из растительного материала, что, вероятно, является причиной увеличения его выхода по сравнению с традиционной методикой. При этом масс-спектрометрия с ионизацией электроспреем позволяет установить наличие кверцетина в продукте. Необходимо отметить, что интервал температур 230 - 270 °С в области до критической точки соответствует максимальному ионному произведению воды, который выше на три порядка по сравнению с обычными условиями (температура 25ºС и давление 1 атм). Субкритическая вода при таких температурах демонстрирует свойства кислотного катализатора (А.А. Галкин, В.В Лунин// Успехи химии. - 2005. - 74. - С.24-40). Вероятно, поэтому, в большинстве изученных далее нами процессов экстракции и модификации оптимальным оказалось использование воды при температуре 250ºС. Дальнейшее развитие предложенная экспериментальная процедура и установка получили при извлечении дигидрокверцетина из отходов древесины. Дигидрокверцетин (ДКВ) 3,3',4',5,7 – пентагидроксифлаванон (II) обладает широким спектром биологической активности: антиоксидантными, капилляропротекторными свойствами в сочетании с противовоспалительным, гастро- и гепатопротекторным, гиполипидемическим и диуретическим действием. ДКВ - действующее вещество препарата «Капилар»). В настоящее время известно множество различных способов извлечения дигидрокверцетина из растительного сырья, основанных на извлечении ДКВ с помощью полярных органических растворителей (водно-ацетоновый раствор, метилтретбутиловый эфир, водно-спиртовый раствор, этилацетат) с последующей очисткой на сорбентах и перекристаллизацией. На этом этапе работы выполнена экстракция дигидрокверцетина субкритической водой в проточном режиме (рис.1). По окончании процесса полученный водный экстракт подвергали анализу на содержания ДКВ. Хроматограмма извлечения из древесины лиственницы субкритической водой в проточном режиме представлена на рисунке 7.  Рис. 7 Хроматограмма экстракции из древесины лиственницы субкритической водой в динамическом режиме (ДКВ – пик со временем удерживания 10,79 мин) Для извлечения ДКВ субкритической водой в проточном режиме были подобраны оптимальные условия . Из полученных данных следует, что при температуре ниже 150 °С, а также свыше 190 °C выход дигидрокверцетина уменьшается в несколько раз. Это может быть объяснено тем, что при более низкой температуре вода слабее проявляет экстракционные свойства, а при более высокой происходит разрушение дигидрокверцетина. В результате исследований установлены оптимальные условия извлечения дигидрокверцетина в среде субкритической воды: температура 160-180ºС и давление 80,5-87,5 атм (выделение 2,73 г ДКВ из 1кг опилок). Для сравнения эффективности различных методов экстракции ДКВ представлены в таблице 2 (доля эффективности извлечения традиционным методом извлечения принята за 1). Таблица 2. Эффективность различных методов экстракции ДКВ.
| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Добавить документ в свой блог или на сайт
Похожие:
 | Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт физиологически активных веществ ран | | Бад к пище являются концентраты натуральных или идентичных натуральным биологически активных веществ, предназначенных для непосредственного... |
| Целью освоения дисциплины является формирование у студентов знаний основ биотехнологии, позволяющих им успешно решать профессиональные... | | Материал дисциплины базируется на знаниях по органической химии, «Актуальные задачи современной биоорганической химии», «Биологически... |
| Целями освоения дисциплины Теоретические основы органической химии биологически активных добавок являются | | Занятие №17. Химия биологически активных гетерофункциональных и гетероциклических низкомолекулярных органических веществ |
| Специальность 05. 18. 15 – Товароведение пищевых продуктов и технология продуктов общественного питания | | «Химия», магистерская программа «Фармакохимия биологически активных веществ». В состав умк включены: программа курса лекций, структура... |
| Сформировать представление о витаминах как биологически активных веществах клетки, об их влиянии на обменные процессы | | Электронное строение атома углерода. Природа и типы химических связей в органических соединениях |